新版GBT16294要求：沉降菌用培养基暴露时间确认方案

新版GB/T 16294-2025《医药工业洁净室(区)沉降菌的测试方法》对沉降菌培养皿暴露时间提出了新要求，明确需确认单个培养皿的最佳暴露时间，且暴露时间一般不超过4小时，同时补充了培养基促生长能力的验证要求；相较于旧版，新版不再允许简单将短时间暴露结果换算为4小时结果，需通过试验确定适宜的暴露时长，以避免因培养基脱水、菌落生长竞争等因素导致检测结果失真，确保沉降菌监测数据的准确性和代表性。以下为具体方案：

1.确认目的

确认沉降菌监测用培养基在0.5小时、2小时、4小时暴露时间下，外观无异常且仍具备良好的促生长能力，且在经过5天的培养后，培养基仍然符合《中华人民共和国药典2025年版四部通则1105》及GB/T 16294-2025《医药工业洁净室(区)沉降菌的测试方法》要求，为沉降菌监测提供可靠的培养基暴露时间依据。

2.确认依据

2.1《中华人民共和国药典2025年版四部通则1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》
2.2 GB/T 16294-2025《医药工业洁净室(区)沉降菌的测试方法》

3.适用范围

本方案适用于沉降菌监测用胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）在规定暴露时间下的性能确认，涵盖外观质量及培养基适用性验证。

4.试验材料与设备

4.1培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA），每皿倾注量为15ml（药典要求15-20ml，本次确认采用最不利条件，选择15ml进行确认），符合《中华人民共和国药典2025年版四部》要求。

4.2试验菌种：

采用《中华人民共和国药典2025年版四部通则1105》规定的5种标准菌株，传代次数不超过5代：
1）金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC(B)26003
2）铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CMCC(B)10104
3）枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CMCC(B)63501
4）白色念珠菌（Candida albicans）CMCC(F)98001
5）黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC(F)98003

4.3主要设备：

1）洁净培养箱（30~35℃、20~25℃）
2）压力蒸汽灭菌器
3）生物安全柜、超净工作台
4）菌落计数器
5）无菌培养皿（直径90mm）
6）温湿度计、压差计（用于环境参数监测）

5.确认条件

5.1测试环境：选择公司换气次数最大的洁净房间，测试前净化空调系统正常运行不少于30分钟，维持静态环境（无生产操作），实时监测并记录温湿度、压差、换气次数等环境参数。

5.2采样点设置：基于房间布局及风险评估，确定3个代表性采样点（如房间对角线三点、气流关键区域等），每个采样点放置18个无菌培养皿（每皿培养基15ml）。

6.确认步骤

6.1培养基制备：按培养基说明书配制TSA培养基，121℃压力蒸汽灭菌15分钟，灭菌后在超净工作台内倾注无菌培养皿，每皿控制15ml，待培养基自然凝固（表面平整无气泡）后备用。同时制备同批次未暴露的培养基，作为菌液对照组。

6.2暴露操作：

1）按设定的3个采样点，每个点均匀摆放18个凝固后的培养基，打开皿盖使培养基表面完-全暴露于空气中，记录暴露开始时间。

2）严格控制暴露时间，分别在0.5小时、2小时、4小时时间节点，从每个采样点取出6个培养皿，具体分组标记：
1个标记为“供试品组"，作为暴露环境的空白对照；
5个分别标记为“试验组-金黄色葡萄球菌"“试验组-铜绿假单胞菌"“试验组-枯草芽孢杆菌"“试验组-白色念珠菌"“试验组-黑曲霉"，分别对应5种试验菌种；
剩余培养皿继续按设定时间暴露，直至所有时间节点完成取样。

6.3外观检查：暴露取样后，立即对各时间梯度的供试品组、试验组培养基进行外观观察，重点检查是否存在干裂、收缩、表面不平整、水珠凝聚过多等异常现象，详细记录每个平板的观察结果。

6.4培养基适用性试验：

1）菌液制备：将5种标准菌株分别接种至适宜液体培养基（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌接种胰酪大豆胨液体培养基，30~35℃培养18~24小时；白色念珠菌接种沙氏葡萄糖液体培养基，20~25℃培养24~48小时；黑曲霉接种沙氏葡萄糖液体培养基，20~25℃培养5~7天），培养至对数生长期后，用无菌生理盐水梯度稀释至约100cfu/ml，备用。

2）接种操作：
供试品组：取各时间梯度的供试品组培养基，不接种菌液，作为供试品对照；
试验组：取各时间梯度对应菌种的试验组培养基，分别接种对应菌液0.1ml，用无菌涂布棒均匀涂布；
菌液对照组：取未暴露的培养基，分别接种5种菌液各0.1ml，作为菌液浓度对照。
阴性对照组：取未暴露的培养基，不接种菌液作为阴性对照。

3）培养：

试验组：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌接种后的培养基，置于30~35℃培养5天；
试验组：白色念珠菌、黑曲霉接种后的培养基，置于20~25℃培养5天。

菌液组：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌接种后的培养基，置于30~35℃培养3天；
菌液组：白色念珠菌、黑曲霉接种后的培养基，置于20~25℃培养5天。

供试品组：置于30~35℃培养5天。
阴性对照：置于30~35℃培养5天。

4）菌落计数：
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌接种后的培养基培养3天后，用菌落计数器分别计数各供试品组、试验组、菌液对照组的菌落数，阴性对照组应无菌生长。
白色念珠菌、黑曲霉接种后的培养基培养5天后，用菌落计数器分别计数各供试品组、试验组、菌液对照组的菌落数，阴性对照组应无菌生长。

7.数据计算与可接受标准

7.1数据计算

每种试验菌的回收率计算公式：
回收率 =（同时间点同采样点试验组菌落数 - 同时间点同采样点供试品组菌落数）÷ 同菌种菌液对照组菌落数
注：每组菌落数取3个采样点对应平板的平均值。

7.2可接受标准

外观要求：培养完毕后所有暴露时间梯度的供试品组、试验组培养基均应外观均匀、表面平整，无干裂、无收缩、无水珠凝聚导致的菌落蔓延现象。

微生物指标：
阴性对照组：平板应无菌生长，否则试验无效；
菌液对照组：每种试验菌的平均菌落数应在80~100cfu范围内（确保菌液浓度准确）；
试验组：每种试验菌的回收效率应在0.5~2.0范围内。

8.结果记录与报告

建立详细记录表格，记录内容包括：培养基制备信息、环境参数（温湿度、压差、换气次数）、采样点位置、暴露时间、外观检查结果、各组菌落计数数据、回收效率计算结果。

汇总所有数据，按可接受标准进行逐项判定，出具确认报告，明确各暴露时间下培养基是否符合要求。

9.确认结论

根据外观检查及培养基适用性试验结果，综合判定0.5小时、2小时、4小时暴露时间下，沉降菌用培养基是否满足监测要求，确定适宜的培养基暴露时间范围。如2小时的满足要求，4小时的不满足要求，则定最佳培养基暴露时间为2小时。（时间达到后需要更换新的培养基）。

10.偏差处理

若确认过程中出现外观异常、阴性对照组有菌生长或回收效率超出规定范围，应立即终止试验，调查偏差原因（如培养基制备过程、暴露环境控制、操作污染等），采取纠正措施后重新开展确认。

11.再确认周期

当培养基配方变更、生产工艺调整、测试环境发生重大变化时，需重新进行本确认；正常情况下，每3年进行一次再确认。