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    GB4789.13-2012 食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验

    发布时间: 2019-04-03  点击次数: 2748次

                                                      中华人民共和国国家标准
                                                          GB 4789.13—2012
                                                           食品安全国家标准
                                            食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验
    中华人民共和国卫生部发布
    2012-05-17 发布2012-07-17 实施
    GB 4789.13—2012
    I
    前言
    本标准代替GB/T 4789.13—2003《食品卫生微生物学检验产气荚膜梭菌检验》。
    本标准与GB/T 4789.13—2003 相比,主要变化如下:
    ——修改了标准的中文名称;
    ——修改了样品制备过程;
    ——修改了培养基与试剂;
    ——修改了操作步骤;
    ——修改了菌数计算部分;
    ——增加了附录A。
    GB 4789.13—2012
    1
    食品安全国家标准
    食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验
    1 范围
    本标准规定了食品中产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的检验方法。
    本标准适用于食品中产气荚膜梭菌的检验。
    2 设备和材料
    除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
    a) 恒温培养箱:36 ℃±1 ℃;
    b) 冰箱:2 ℃~5℃;
    c) 恒温水浴箱:50℃±1 ℃,46℃±0.5℃;
    d) 天平:感量0.1 g;
    e) 均质器;
    f) 显微镜:10×~100×;
    g) 无菌吸管:1 mL(具0.01 mL 刻度)、10 mL(具0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头;
    h) 无菌试管:18mm×180mm;
    i) 无菌培养皿:直径90 mm;
    j) pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸;
    k) 厌氧培养装置。
    3 培养基和试剂
    3.1 胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸(TSC)琼脂:见附录A 中A.1。
    3.2 液体硫乙醇酸盐培养基(FTG):见附录A 中A.2。
    3.3 缓冲动力-硝酸盐培养基:见附录A 中A.3。
    3.4 乳糖-明胶培养基:见附录A 中A.4。
    3.5 含铁牛乳培养基:见附录A 中A.5。
    3.6 0.1%蛋白胨水:见附录A 中A.6。
    3.7 革兰氏染色液:见附录A 中A.7。
    3.8 硝酸盐还原试剂:见附录A 中A.8。
    3.9 缓冲甘油-氯化钠溶液:见附录A 中A.9。
    4 检验程序
    GB 4789.13—2012
    2
    产气荚膜梭菌检验程序见图1。


    5 操作步骤
    5.1 样品制备
    5.1.1 样品采集后应尽快检验,若不能及时检验,可在2 ℃~5 ℃保存;如8 h 内不能进行检验,应以
    无菌操作称取25 g(mL)样品加入等量缓冲甘油-氯化钠溶液(液体样品应加双料),并尽快至于-60 ℃
    低温冰箱中冷冻保存或加干冰保存。
    5.1.2 以无菌操作称取25 g(mL)样品放入含有225 mL 0.1%蛋白胨水(如为5.1.1 中冷冻保存样品,
    室温解冻后,加入200 mL 0.1%蛋白胨水)的均质袋中,在拍击式均质器上连续均质1 min~2 min;或
    置于盛有225 mL0.1%蛋白胨水的均质杯中,8 000 r/min~10 000 r/min 均质1min~2 min,作为1:10 稀释
    液。
    5.1.3 以上述1:10 稀释液按1 mL 加0.1%蛋白胨水9 mL 制备10-2~10-6 的系列稀释液。
    检样
    25g(mL)检样+225 mL0.1%蛋白胨水
    均质、稀释
    10-1~10-6 稀释液各1mL + TSC 琼脂混合
    厌氧培养,36℃±1℃、20h~24h,黑色菌落计数
    任选黑色菌落5 个,分别接种FTG 培养基
    确证试验
    镜检形态 牛奶发酵 动力-硝酸盐 乳糖-明胶
    报告
    GB 4789.13—2012
    3
    5.2 培养
    5.2.1 吸取各稀释液1 mL 加入无菌平皿内,每个稀释度做两个平行。每个平皿倾注冷却至50 ℃的TSC
    琼脂(可放置于50 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温)15 mL,缓慢旋转平皿,使稀释液和琼脂充分混匀。
    5.2.2 上述琼脂平板凝固后,再加10 mL 冷却至50 ℃的TSC 琼脂(可放置于50 ℃±1 ℃恒温水浴箱
    中保温)均匀覆盖平板表层。
    5.2.3 待琼脂凝固后,正置于厌氧培养装置内,36 ℃±1 ℃培养20 h~24 h。
    5.2.4 典型的产气荚膜梭菌在TSC 琼脂平板上为黑色菌落。
    5.3 确证试验
    5.3.1 从单个平板上任选5 个(小于5 个全选)黑色菌落,分别接种到FTG 培养基,36 ℃±1 ℃培养
    18 h~24 h。
    5.3.2 用上述培养液涂片,革兰氏染色镜检并观察其纯度。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗短的杆菌,有
    时可见芽孢体。如果培养液不纯,应划线接种TSC 琼脂平板进行分纯,36 ℃±1 ℃厌氧培养20 h~24 h,
    挑取单个典型黑色菌落接种到FTG 培养基,36 ℃±1 ℃培养18 h~24 h,用于后续的确证试验。
    5.3.3 取生长旺盛的FTG 培养液1 mL 接种于含铁牛乳培养基,在46 ℃±0.5 ℃水浴中培养2 h 后,每
    小时观察一次有无“暴烈发酵”现象,该现象的特点是乳凝结物破碎后快速形成海绵样物质,通常会上
    升到培养基表面。5 h 内不发酵者为阴性。产气荚膜梭菌发酵乳糖,凝固酪蛋白并大量产气,呈“暴烈发
    酵”现象,但培养基不变黑。
    5.3.4 用接种环(针)取FTG 培养液穿刺接种缓冲动力-硝酸盐培养基,于36 ℃±1 ℃培养24 h。在透
    射光下检查细菌沿穿刺线的生长情况,判定有无动力。有动力的菌株沿穿刺线呈扩散生长,无动力的菌
    株只沿穿刺线生长。然后滴加0.5 mL 试剂甲和0.2 mL 试剂乙以检查亚硝酸盐的存在。15 min 内出现红
    色者,表明硝酸盐被还原为亚硝酸盐;如果不出现颜色变化,则加少许锌粉,放置10 min,出现红色者,
    表明该菌株不能还原硝酸盐。产气荚膜梭菌无动力,能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。
    5.3.5 用接种环(针)取FTG 培养液穿刺接种乳糖-明胶培养基,于36 ℃±1 ℃培养24 h,观察结果。
    如发现产气和培养基由红变黄,表明乳糖被发酵并产酸。将试管于5 ℃左右放置1 h,检查明胶液化情况。
    如果培养基是固态,于36 ℃±1 ℃再培养24 h,重复检查明胶是否液化。产气荚膜梭菌能发酵乳糖,使
    明胶液化。
    6 结果与报告
    6.1 典型菌落计数
    选取典型菌落数在20 CFU~200 CFU 之间的平板,计数典型菌落数。如果:
    a) 只有一个稀释度平板的典型菌落数在20CFU~200CFU 之间,计数该稀释度平板上的典型菌落;
    b)低稀释度平板的典型菌落数均小于20 CFU,计数该稀释度平板上的典型菌落;
    c)某一稀释度平板的典型菌落数均大于200 CFU,但下一稀释度平板上没有典型菌落,应计数该稀
    释度平板上的典型菌落;
    d)某一稀释度平板的典型菌落数均大于200 CFU,且下一稀释度平板上有典型菌落,但其平板上的
    典型菌落数不在20 CFU~200 CFU 之间,应计数该稀释度平板上的典型菌落;
    e)2 个连续稀释度平板的典型菌落数均在20CFU~200CFU 之间,分别计数2 个稀释度平板上的典
    型菌落。
    6.2 结果计算
    6.1 计数结果按公式(1)计算:
    GB 4789.13—2012



    式中:
    T——样品中产气荚膜梭菌的菌落数;
    A——单个平板上典型菌落数;
    B——单个平板上经确证试验为产气荚膜梭菌的菌落数;
    C——单个平板上用于确证试验的菌落数;
    n1 ——稀释度(低稀释倍数)经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数;
    n2 ——第二稀释度(高稀释倍数)经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数;
    0.1——稀释系数;
    d——稀释因子(稀释度)。
    6.3 报告
    根据TSC 琼脂平板上产气荚膜梭菌的典型菌落数,按照6.2 中公式计算,报告每g(mL)样品中产
    气荚膜梭菌数,报告单位以CFU/ g(mL)表示;如T 值为0,则以小于1 乘以低稀释倍数报告。

    GB 4789.13—2012
    5
    附录A
    培养基和试剂
    A.1 胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸(TSC)琼脂
    A.1.1 基础成分
    胰胨15.0 g
    大豆胨5.0 g
    酵母粉5.0 g
    焦亚硫酸钠1.0 g
    柠檬酸铁铵1.0 g
    琼脂15.0 g
    蒸馏水900.0 mL
    pH 7.6±0.2
    A.1.2 D-环丝氨酸溶液
    溶解1 gD-环丝氨酸于200 mL 蒸馏水,膜过滤除菌后,于4 ℃冷藏保存备用。
    A.1.3 制法
    将基础成分加热煮沸至*溶解,调节pH,分装到500 mL 烧瓶中,每瓶250 mL,121 ℃高压灭菌
    15 min,于50 ℃±1 ℃保温备用。临用前每250 mL 基础溶液中加入20 mL D-环丝氨酸溶液,混匀,倾注
    平皿。
    A.2 液体硫乙醇酸盐培养基(FTG)
    A.2.1 成分
    胰蛋白胨15.0 g
    L-胱氨酸0.5g
    酵母粉5.0 g
    葡萄糖5.0 g
    氯化钠2.5g
    硫乙醇酸钠0.5g
    刃天青0.001g
    琼脂0.75g
    蒸馏水1 000.0 mL
    pH 7.1±0.2
    A.2.2 制法
    将以上成分加热煮沸至*溶解,冷却后调节pH,分装试管,每管10 mL,121 ℃高压灭菌15 min。
    临用前煮沸或流动蒸汽加热15 min,迅速冷却至接种温度。
    A.3 缓冲动力-硝酸盐培养基
    A.3.1 成分
    蛋白胨5.0 g
    牛肉粉3.0 g
    硝酸钾5.0 g
    磷酸氢二钠2.5g
    GB 4789.13—2012
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    半乳糖5.0 g
    甘油5.0 mL
    琼脂3.0 g
    蒸馏水1 000.0 mL
    pH 7.3±0.2
    A.3.2 制法
    将以上成分加热煮沸至*溶解,调节pH,分装试管,每管10 mL,121 ℃高压灭菌15 min。如果
    当天不用,置4 ℃左右冷藏保存。临用前煮沸或流动蒸汽加热15 min,迅速冷却至接种温度。
    A.4 乳糖-明胶培养基
    A.4.1 成分
    蛋白胨15.0 g
    酵母粉10.0 g
    乳糖10.0 g
    酚红0.05g
    明胶120.0 g
    蒸馏水1 000.0 mL
    pH 7.5±0.2
    A.4.2制法
    加热溶解蛋白胨、酵母粉和明胶于1000 mL 蒸馏水中,调节pH,加入乳糖和酚红。分装试管,每
    管10 mL,121 ℃高压灭菌10 min。如果当天不用,置4 ℃左右冷藏保存。临用前煮沸或流动蒸汽加热
    15 min,迅速冷却至接种温度。
    A.5 含铁牛乳培养基
    A.5.1 成分
    新鲜全脂牛奶1 000.0 mL
    硫酸亚铁(FeSO4·7H2O) 1.0 g
    蒸馏水50.0 mL
    A.5.2 制法
    将硫酸亚铁溶于蒸馏水中,不断搅拌,缓慢加入1000 mL 牛奶中,混匀。分装大试管,每管10 mL,
    118 ℃高压灭菌12 min。本培养基必须新鲜配制。
    A.6 0.1% 蛋白胨水
    A.6.1 成分
    蛋白胨1.0 g
    蒸馏水1 000.0 mL
    pH 7.0±0.2
    A.6.2制法
    加热溶解,调节pH,121 ℃高压灭菌15 min。
    A.7 革兰氏染色液
    A.7.1 结晶紫染色液
    A.7.1.1 成分
    结晶紫1.0g
    GB 4789.13—2012
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    95%乙醇20.0 mL
    1%草酸铵水溶液80.0 mL
    A.7.1.2 制法
    将结晶紫*溶于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。
    A.7.2 革兰氏碘液
    A.7.2.1 成分
    碘1.0 g
    碘化钾2.0 g
    蒸馏水300.0 mL
    A.7.2.2 制法
    将碘与碘化钾先混合,加入蒸馏水少许振摇,待*溶解后,再加入蒸馏水至300 mL。
    A.7.3 沙黄复染液
    A.7.3.1 成分
    沙黄0.25 g
    95%乙醇10.0 mL
    蒸馏水90.0 mL
    A.7.3.2 制法
    将沙黄溶解于95%乙醇中,然后用蒸馏水稀释。
    A.7.4 染色方法
    涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染液,染色1 min,水洗。滴加革兰氏碘液,作用1 min,水洗。滴
    加95%乙醇脱色约15 s~30 s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗。滴加沙黄复染液,复染1 min,
    水洗、待干、镜检。
    A.8 硝酸盐还原试剂
    A.8.1 甲液(对氨基苯磺酸溶液)
    在1 000 mL 5 mol/L 乙酸中溶解8 g 对氨基苯磺酸。
    A.8.2 乙液(α-萘酚乙酸溶液)
    在1 000 mL 5 mol/L 乙酸中溶解5 g α-萘酚。
    A.9 缓冲甘油-氯化钠溶液
    A.9.1 成分
    甘油100.0 mL
    氯化钠4.2 g
    磷酸氢二钾(无水) 12.4 g
    磷酸二氢钾(无水) 4.0 g
    蒸馏水900.0 mL
    pH7.2±0.1
    A.9.2 制法
    将以上成分加热至*溶解,调节pH,121 ℃高压灭菌15 min。配制双料缓冲甘油溶液时,用甘油
    200 mL和蒸馏水800 mL。

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